УДК 504.055(043.5)

Туберкульоз є однією з найактуальніших соціально-політичних та медичних проблем сучасного суспільства в світовому вимірі. Протитуберкульозна служба в Україні представлена протитуберкульозними диспансерами, фтизіатричними лікарнями для дорослих та дітей, а також фтизіатричними кабінетами в закладах загальної лікувальної мережі (ЗЛМ), які надають амбулаторно-поліклінічну допомогу. Відповідно до Загальнодержавної програми протидії захворюванню на туберкульоз на 2007-2011 роки створено мережу лабораторій з бактеріологічної діагностики туберкульозу. Лабораторії І рівня знаходяться в складі клініко-діагностичних лабораторій (КДЛ) лікувально-профілактичних закладів ЗЛМ та проводять мікроскопію мазка біоматеріалу, пофарбованого за методом Ціля-Нільсена, для виявлення кислотостійких бактерій (КСБ). В складі протитуберкульозних закладів знаходяться лабораторії ІІ рівня, які мають можливості проводити виділення збудника культуральним методом. Лабораторії ІІІ рівня мають проводити дослідження з метою ідентифікації виділених культур та ставити тести чутливості до протимікробних засобів.

Достовірний діагноз може бути встановлений лише при виділенні і ідентифікації збудника за допомогою бактеріологічного дослідження патологічного матеріалу (мокротиння). При використанні відповідних методів деконтамінації мокротиння і оптимальних живильних середовищ можна виявити мікобактерії туберкульозу (МБТ) навіть у хворих, в мокроті яких міститься всього десять життєздатних клітин збудника. При недостатньо ефективній деконтамінації, недотриманні правил асептики на будь-якому етапі роботи з матеріалом, використанні забруднених реактивів, порушенні стерильності можлива крос-контамінація сторонньою флорою. Причини контамінації залежать від декількох факторів і вони різні для окремих лабораторій [1,2,3]. За даними літератури та власними спостереженнями частіше за все забруднення посівів відбувається здебільшого грибковою флорою [4]. У практичній діяльності нерідко можуть зустрічатись такі випадки, коли на середовищі отримано одиничні характерні колонії, але їх ідентифікація унеможливлюється за рахунок наявності сторонньої флори. Особливо прикро, якщо цей матеріал отримано під час хірургічних втручань, або від діагностичних хворих, які за різних причин не мають можливості здати аналіз повторно. Лабораторія забов’язана забезпечити якісне та достовірне дослідження, тому в таких випадках необхідно ізолювати чисту культуру мікроба та провести її ідентифікацію.

Мета: порівняння ефективності відомих способів обробки контамінованих культур М.tuberculosis.

Матеріали і методи. Посівний матеріал було отримано від пацієнтів бактеріовиділювачів, які знаходяться на лікуванні в Харківському обласному протитуберкульозному диспансері №1. Передпосівна обробка матеріалу проводилась модифікованим методом Петрова 4% розчином гідроксиду натрію відповідно до Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (наказ МОЗУ від 06.02.2002р. №45). Для виявлення ефективності пригнічення супутньої мікрофлори в забруднених посівах відібрано 12 культур, які були частково забруднені різною сторонньою (переважно грибковою) мікрофлорою, що суттєво ускладнювало їх подальшу ідентифікацію. Кожен дослід проводився в трьох серіях для кожної культури (n=36). У якості контролю використовувалась чиста культура референс-штаму M. tuberculosis H37Rw.
Обробка забруднених культур проводилася наступним чином: з кожного зразка робили розведення 1MF; до 1мл суспензії додавали розчини гідроксиду натрію (кінцева концентрація в пробі 1% та 1,5%), сірчаної кислоти (кінцева концентрація в пробі 3%), розчин 0,1% хлоргексидину в співвідношені 3:1, суміші антибіотиків РANTA (поліміксин В 200од/мл, амфотерицин В 10мг/мл, налідіксова кислота 40мг/мл, триметоприм 10мг/мл, азоциллін 10мг/мл) в співвідношенні 2,5:1.

Матеріал обробляли 20 хвилин при температурі 37оС, центрифугували при 3500g, надосадову рідину зливали, осад розводили 1-2 мл фізіологічного розчину та робили засів 0,2 мл на тверді поживні середовища Левенштейна-Йенсена та Фінна ІІ. Інкубацію посівів проводили в термостаті при температурі 37оС протягом 12 тижнів, посіви переглядались 2 рази на тиждень.

Результати та висновки. Ефективність обробки оцінювалась за ступенем пригнічення сторонньої флори, наявності росту колоній мікобактерій та швидкості їх отримання. Визначили зразки, в яких вдалося отримати чисту культуру (швидкість росту 18-37 діб); зразки, які залишились забрудненими, але виросли колонії МБТ (швидкість росту 24-28 діб); зразки, обробка яких призвела до загибелі всіх мікроорганізмів; зразки, в яких дія деконтамінантів виявилась неефективною і досить жорсткою по відношенню до МБТ (табл. 1).

Табліця 1. Ефективність пригнічення супутньої флори і М.tuberculosis у забруднених культурах (n=36) під дією деконтамінантів

В нашому досліді вдалося вилучити чисту культуру із забруднених зразків за допомогою зазначених способів. Найкращі результати отримано при застосуванні суміші антибіотиків PANTA –чисту культуру ізольовано майже в 70 % зразків. Але цей спосіб є досить дорогим і недоступним для деяких лабораторій.

Застосування 0,1 % розчину хлоргексидину не виправдало себе, в 61,12 % зразки залишились забрудненими, отримати культуру вдалося лише в 22,22 % проб. Цікаво, що в 8,33 % не отримано росту взагалі, хоча обробка контрольного зразка пригнічення мікобактерій не виявила. Крім того, використання антисептика потребує також суттєвих фінансових витрат.

Обробка забрудненого матеріалу сірчаною кислотою є недостатньо ефективною, лише в 19,44 % зразків отримано чисту культуру, а близько 22,22 % зразків виявились забрудненими.

Зразки, оброблені розчином луги (кінцева концентрація 1 % в матеріалі), в 25 % проб не мали росту, а зразків з проростами було більше, ніж тих, де отримано чисту культуру (38,44 % і 30,56 % відповідно).

Використання розчину гідроксиду натрію з кінцевою концентрацією 1,5 % в пробі в половині випадків дозволяє отримати чисту культуру, добре пригнічує супутню флору (проросли лише 16,67 % проб), проте для третини зразків (33,33 %) є надто жорстким і повністю знищує мікрофлору.
Результати проведених досліджень показали, що при використанні нескладних методів обробки культур мікобактерій, які частково забруднені сторонньою флорою, можливо ізолювати чисту культуру та провести її ідентифікацію. Крім того, посіви з частковим забрудненням бажано витримати до закінчення терміну інкубації або до розвитку хоч би декількох колоній мікобактерій, оскільки пізня поява забруднення не виключає зростання M.tuberculosis. В таких випадках необхідно зробити мазок, забарвити його по методу Циля-Нільсена і за наявності кислотостійких мікобактерій спробувати обробити культуру, що виросла, сумішшю антибіотиків PANTA в співвідношенні 2,5:1, або розчином гідроксиду натрію при кінцевій концентрації 1,5 % в пробі.

Література

1. Наказ МОЗ Україні від 06.02.2002р. №45 «Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції»
2. Лабораторна служба по боротьбі з туберкульозом. Культуральне дослідження. Частина 3./  Karin Weyer і соавт.   Женева, ВООЗ, 1998. — с.37-46
3. Культуральні методи діагностики туберкульозу. Навчальний посібник для проведення базового курсу фахівців бактеріологічних лабораторій установ протитуберкульозної служби./   ред. В.В. Ерохина. — Тверь, «Тріада», 2008. — с.87-99.
4. PAHO/WHO Advisory Committee on Tuberculosis Bacteriology. Manual of Technical Standards and Procedures for Tuberculosis Bacteriology. Part II: The culture of Mycobacterium tuberculosis. Pan American Health Organization, Martinez, Argentina, 1998.
УДК 504.055(043.5)

ЕФЕКТИВНІСТЬ РІЗНИХ СПОСОБІВ ОБРОБКИ ЗАБРУДНЕНОЇ КУЛЬТУРИ M.TUBERCULOSIS З МЕТОЮ ІЗОЛЯЦІЇ ЧИСТОЇ КУЛЬТУРИ
Ковальова Г.О., Сенчева Т.В., Волянський А.Ю., Танасов С.В., Мартиросян І.О.
ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова НАМН Україні»
Проведено дослідження 12 культур мікобактерій, що були частково забруднені сторонньою флорою. З метою ізоляції чистої культури матеріал обробляли розчинами гідроксиду натрію, сірчаної кислоти, хлоргексидину та сумішшю антибіотиків PANTA. Найкращі результати було отримано при застосуванні PANTA в співвідношенні 2,5:1.
УДК 504.055(043.5)

ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗНЫХ СПОСОБОВ ОБРАБОТКИ ЗАГРЯЗНЕННОЙ КУЛЬТУРЫ M.TUBERCULOSIS С ЦЕЛЬЮ ИЗОЛЯЦИИ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
Ковалева А.А., Сенчева Т.В., Волянский А.Ю., Танасов С.В., Мартиросян И.О.
ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины»
Проведено исследование 12 культур микобактерий, которые были частично загрязнены посторонней флорой. С целью изоляции чистой культуры материал обрабатывали растворами гидроксида натрия, серной кислоты, хлоргексидина и смесью антибиотиков PANTA. Наилучшие результаты были получены при применении PANTA в соотношении 2,5:1.
UDC 504.055(043.5)

EFFICIENCY OF DIFFERENT METHODS OF PROCESSING POLLUTED M. TUBERCULOSIS CULTURE FOR INSULATION OF PURE CULTURES
PI «Institute of Microbiology and Immunology of the name of I.I. Mechnikov National Academy of Medical Sciences of Ukraine»
Kovalyova G.O., Sencheva T.V., Volianskij А.Yu., Tanasov S.V., Martуrosian I.O.
Was studied 12 cultures of mycobacteria, which were partly contaminated by extraneous flora. With the purpose of isolation of а pure culture material was processed with solutions of sodium hydroxide, sulfuric acid, chlorhexidine and antibiotic mixture PANTA. The best results were got at application of PANTA in the ratio of 2,5:1.

Г.О.Ковальова, Т.В.Сенчева, А.Ю.Волянський, С.В.Танасов, І.О.Мартиросян,
ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова НАМН Україні»