И.Г.Кольцова, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и эпидемиологии ОМУ, научный консультант фирмы «Симеста ВААЛ»

В связи с возможностью возникновения в Украине широкомасштабной эпидемии, вызванной новым высокопатогенным вирусом гриппа А (H1N1) возникает необходимость максимальной информированности органов практического здравоохранения о возможностях специфической лабораторной диагностики как самого гриппа (и его эпидемического варианта — свиного гриппа), так и быстрой дифференциальной диагностики гриппа с другими ОРЗ.
Настоящее сообщение содержит краткую информацию о предложениях фирмы «Симеста» по тестам, рекомендованным к использованию в приказе МЗ Украины от 20.05.2009 № 189-Адм «Протокол диагностики и лечения нового гриппа А (H1N1) (Калифорния) у взрослых».
Как известно, лабораторная диагностика инфекционного заболевания условно может быть поделена на экспресс-диагностику (несколько часов для получения результата), раннюю ( в первые дни от начала заболевания) и позднюю, иногда — ретроспективную (не менее 7-10 дней от начала заболевания). Как правило, экспресс-диагностика и ранняя диагностика при гриппе и других ОРЗ направлены на прямое выявление возбудителя или его антигенов, для поздней и ретроспективной диагностики пользуются методами, в основе которых лежит выявление антител к возбудителю.

Для экспресс-диагностики могут быть использованы:
а) реакция иммунофлюоресценции с использованием флюоресцирующих антител для диагностики респираторных вирусных инфекций (гриппа, парагриппа, РС- и аденовирусной инфекций). Метод основан на взаимодействии вирусного антигена в материале от больного с антителами, меченными флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Образующийся специфический комплекс обнаруживают в виде ярко люминесцирующих изумрудно-зеленым цветом конгломератов в ядре и цитоплазме зараженных клеток. Что очень важно — результат может быть получен в течение 1,5 часов от момента получения материала.
Рекомендуемые сроки взятия материала: для гриппа — 1-4-й дни, для парагриппа — 1-6-й дни, для РС- и аденовирусной инфекции — 1-7-й дни. Чувствительность и специфичность метода при параллельном исследовании образцов культуральным методом с использованием реакции нейтрализации составляет 85-96%.
Хорошо зарекомендовали себя сыворотки, предлагаемые НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера(С-П), которые предлагаются как для диагностики отдельных возбудителей, так и для комплексной диагностики.
На рис.1 представлены наборы люминесцирующих сывороток к вирусам гриппа А,В, парагриппа 1-3 типов, РС и аденовирусу PathoDx Respiratory Virus Panel, производства DPC, США.



б) Иммунохроматографические экспресс-методы предназначены для быстрого качественного определения антигенов (нуклеопротеинов) вирусов гриппа типа А и В, в материале из дыхательных путей. Данные тесты могут определять различные подтипы вируса гриппа А, включая cвиной подтип Н1N1 и птичьи подтипы Н5N3, H5N1, H7N3, Н9N2. К тестам придается экстракционный буфер, в который помещается стерильный тампон с материалом от пациента. Готовая смесь наносится в лунки специальных картриджей, результат считывается через 10-15 минут.
Чувствительность и специфичность метода по сравнению с культуральным методом составила 76% и 92%, с референсным иммунохроматографическим методом — 99,1% и 98,4% соответственно.
В наличии имеются иммунохроматографические тесты Rapid Influenza A/B Test Panel, производства DFI, Южная Корея.
в) Метод полимеразной цепной реакции, предназначен для выявления нуклеиновых кислот возбудителя и является наиболее чувствительным и достоверным методом диагностики, позволяет очень быстро и точно установить диагноз. На сегодняшний день существуют наборы тестов для диагностики гриппа и ОРЗ как методом обычной ПЦР, так и для ПЦР в реальном времени.
Немецкая фирма-производитель Genekam Technology предлагает тест-системы, позволяющие определить нуклеиновые кислоты различных штаммов вируса гриппа А H1N1 (сезонных штаммов, штаммов свиного эпидемического гриппа, таких как California, Mexico, New York, Italy, Regensburg, Canada, Brandenburg, Texas, Hamburg, а также штаммов, циркулирующие в популяции свиней), гриппа А (H3N2) и многих других подтипов гриппа А, например, H5N1, H9 и др. Возможно также приобрести тесты, предназначенные для выявления какого-либо определенного подтипа гемагглютинина в комбинации с различными вариантами нейраминидазы, либо определенного подтипа нейраминидазы  в комбинации с различными вариантами гемагглютинина.
Длительность исследования составляет от 4 до 6 часов.
г) Метод биочипов (microarray analysis)
Испанская компания Genomica предлагает к использованию качественно новую методику CLART (Clinical Array Technology) (рисунок 2). Методика заключается в возможности одномоментного определения нуклеиновых кислот нескольких возбудителей, могущих вызвать грипп или другие ОРЗ. При получении от пациента патогенсодержащего материала, из него экстрагируют нуклеиновые кислоты и проводят амплификацию с несколькими праймерами, в зависимости от тест-системы: в тест-системе FluAVir определяются грипп А (Н1N1 свиной и сезонный, H3N2), в тест-системе PneumoVir возможно провести детекцию 17 вирусов, вызывающих респираторные инфекции (гриппа А,B,С, парагриппа 1, 2, 3, 4a и 4b подтипов, РС вируса А и B, риновирусов, аденовирусов, ECHO-вирусов, коронавирусов, бокавирусов, метапневмовирусов А и В). Амплификация проводится в специальных пробирках (рис.3) с нанесенными на дно микрочипами, содержащими нуклеиновые кислоты 17 вирусов.



При получении специфического продукта и при его комплементарном соответствии нуклеиновой кислоте на чипе, происходит их взаимодействие и срабатывает прикрепленная метка, которую можно учесть в специальном ридере. Компьютерная программа расшифровывает результат и печатает его для пациента. Чувствительность и специфичность теста аналогична ПЦР, время проведения теста 8 часов.



Ранняя диагностика основана на выделении вируса из исследуемого материала и его последующей идентификации:
д) вирусологическое выделение вируса гриппа. Вирус гриппа может быть выделен из носоглоточных смывов в течение первых 3-х дней от начала заболевания.Основным методом выделения является заражение развивающихся 10-11-дневных куриных эмбрионов в амниотическую полость с последующей инкубацией при 35°С в течение 3 дней. При вскрытии зараженных эмбрионов определяют наличие вируса в реакции гемагглютинации (РГА) с 1% взвесью эритроцитов кур в аллантоисной и амниотической жидкости, положительные образцы титруют в развернутой РГА. При наличии вирусного антигена в достаточно высоком титре его типируют в серологических реакциях. Серологическая идентификация вируса гриппа проводится в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором иммунных сывороток к эталонным штаммам вирусов этих серологических типов.
В наличии имеются сыворотки диагностические гриппозные сухие производства НИИ гриппа РАМН, ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург. Они представляют собой антитела к вирусам гриппа типа А подтипов А(Hsw1N1), A(H5N1), A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2), других актуальных подтипов и типа В, полученные из гипериммунных сывороток животных (коз, ослов, кроликов, крыс) или птиц (петухов), освобожденные от неспецифических ингибиторов гемагглютинации.
Выделение вируса в культурах клеток в настоящее время мало практикуется в практических лабораториях. Используют культуру клеток почки собаки или обезьян, которые инкубируются при 33 °С роллерным методом. Такое выделение вируса имеет преимущества, так как результаты могут быть получены гораздо быстрее при использовании прямых люминесцирующих сывороток для демонстрации вирусных антигенов. Наличие вируса определяют также с помощью реакции гемадсорбции, а идентификацию — торможения гемадсорбции.
Ввиду сложности и относительной длительности процедуры (4-8 суток) такая диагностика не проводится в лабораториях рутинно, однако, имеет смысл при определении этиологии локальной эпидемии.
Серологический метод диагностики гриппа:
Данный метод позволяет определить наличие у больного противогриппозных антител. Могут определяться антитела к гемагглютинину, нейраминидазе, М-белку, S-белку в зависимости от типа реакции и производителя диагностических систем. Диагностическими критериями при использовании серологического метода диагностики являются наличие IgM антител к вирусам гриппа, либо 4-кратный прирост титров антител в парных сыворотках, взятых у пациентов в первые 5 дней от начала заболевания, а затем на 10-14-й или 21-й день после начала инфекционного заболевания.
а) Метод непрямой иммунофлюоресценции. На слайды с культурами клеток, зараженных различными типами и подтипами вируса гриппа наносят сыворотку крови пациента (возможно в разведениях), инкубируют, промывают от несвязавшихся антител, а затем покрывают меченными ФИТЦ моноклональными антителами к иммуноглобулинам человека класса M, либо G.



Немецкая компания Euroimmun предлагает не только слайды с моночипами, позволяющими определить антитела к какому-либо одному вирусу, а целую Респираторную биочип-мозаику (рис.4), где на одном стекле в 5 рабочих полях вклеено по 4 биочипа с культурами клеток, зараженных вирусами, хламидиями, микоплазмами, а также бактериальными мазками. Такая мозаика позволяет в течение 1,5 часов получить ответ по наличию антител как класса М, так и класса G к 20 возбудителям, вызывающим респираторный синдром (вирусы гриппа А(H1N1), A(H3N2), гриппа В, парагриппа 1-4 типов, РС-, Коксаки А7, В1, ECHO-вирус 7 типа, аденовирусы, а также микоплазмы, хламидии и клебсиеллы пневмонии, бордетелла коклюша, паракоклюша, гемофилы инфлюэнцы и легионеллы1 и 12 типов).Чувствительность и специфичность теста колеблются в зависимости от субстрата от 80 до 100%.
б) Иммуноферментный анализ. В состав тест-систем входят очищенные антигены вирусов гриппа А (различных подтипов), В, при необходимости дифференцировать грипп с другими ОРЗ можно использовать тест-системы с очищенными антигенами РС-вируса, аденовируса, парагриппа. Антигены нанесены на дно лунок микропланшет, после инкубации с сывороткой пациента образовавшийся комплекс «антиген-антитело» отмывается, обрабатывается вторичными антителами к иммуноглобулинам человека классов А, М, G, меченными пероксидазой и «красится» тетраметилбензидином. Больше антител – интенсивнее окраска. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Время исследования, в зависимости от производителя, колеблется между 2 и 4 часами.
Такие системы предлагаются российскими производителями (НИИ гриппа РАМН, ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург) для диагностики вируса гриппа А (субтип H1N1), немецкими производителями r-biopharm и Euroimmun для диагностики гриппа А, B, комплексно А/В (IgA, IgG), а также РС, адено- и парагриппа 1,2.и 3 типов (IgA, IgM, IgG).
в) РТГА используется для определения уровня антител в сыворотках крови пациентов. При наличии антител к определенному вирусу в сыворотке пациента гемагглютинин вируса нейтрализуется и агглютинации эритроцитов не наступает.
Диагностикумы гриппозные для РТГА сухие представляют собой серотипы А (H0N1,H1N1, (H1N1)v, H2N2, H3N2, H5N1 и другие) или В вируса гриппа, антигенно актуальные, авидные к антителам и резистентные к неспецифическим ингибиторам гемагглютинации сывороток людей, выращенные в аллантоисной полости куриных эмбрионов, инактивированные. Производитель - НИИ гриппа РАМН, ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург.
г) Реакция связывания комплемента позволяет выявить антитела к общему антигену для всех штаммов одного серологического типа вируса. Преимуществом данного теста является то, что при использовании РНП вирусов А,В,С в качестве антигена выявляются антитела, формирующиеся только в процессе инфекции, но не в результате вакцинации инактивированными вакцинами. Однако для реакции необходимы дополнительно комплемент, свежие эритроциты барана и гемолитическая сыворотка.
д) Реакция непрямой гемагглютинации — для выявления антител используют эритроцитарные диагностикумы с адсорбированными на поверхности вирусными антигенами.
Каждая из предложенных методик имеет свои достоинства и недостатки по специфичности, чувствительности, времени проведения исследования, необходимости специального оборудования (иммунофлюоресцентный микроскоп, ридер для ИФА, ридер для микрочипов, оборудование для ПЦР), квалифицированного персонала для постановки и интерпретации результатов. Однако широкий спектр предложенных тестов позволяет выбрать для каждой диагностической лаборатории набор доступных методик и достоверно осуществить полную диагностику гриппа, а также дифференцировать его с другими ОРЗ.

По вопросам приобретения тестов обращайтесь в фирму «Симеста ВААЛ»

Контактные телефоны: (0482) 37-56-96, 37-39-12, 34-39-47